随着新技术的不断涌现，高通量测序技术日渐成熟，做为一种革命性的诊疗手段，得到了医学界的广泛认可。2014年北京协和医院成为国内第一批高通量基因测序技术临床应用试点单位之一，高通量测序技术已经在产前诊断、肿瘤、血液病等多个学科发挥了重要作用，给临床诊疗提供了重要支撑。同时，北京协和医院作为全国罕见病诊疗协作网的国家级牵头单位，是罕见感染性疾病患者就诊较多的医疗单位之一。由于传统的病原体涂片、培养等检测技术的检测能力有限，导至临床上对少见病原体和难培养病原体的诊断难度较大，容易导至某些感染病诊断不明甚至误诊漏诊。自从2014年新英格兰医学杂志（NEJM）报道了mNGS成功诊断中枢神经系统钩端螺旋体病后，该技术成为目前国际上感染病诊断的重要前沿技术。宏基因组高通量测序技术具有无偏移、全覆盖、高效率等优势，规避了部分病原体不能培养或难培养的缺点，可直接检测临床样本中的病原体核酸，解决了新发或突发、复杂或混合感染、罕见病原体鉴定难的问题。虽然mNGS目前在临床实用还有较大的改进空间，包括在标本规范采集、核酸提取、建库测序、生信分析、质量控制和结果解读等各环节还可继续优化，实验室的空间设置上也要求较高（需要具备试剂准备间、DNA提取区、RNA提取区、建库区、扩增区、测序区等），但其作为感染病原体的新型实验室诊断技术的重要性已日益凸显。
在医院支持下，徐英春主任早在2016年就委任杨启文副主任开始布局着手组建病原体宏基因组mNGS检测临床和科研平台，现已初步建成集临床检测、科学研究、教学示范多功能为一体的感染病宏基因组检测平台。实验室同时注重与国内mNGS技术研发团队的紧密合作，在核酸提取、去人源、背景核酸识别、快速检测、一体机研发等领域进行深入联合研究。
图1. 宏基因组测序实验室外景
图2. 杨启文副主任指导操作人员进行检测
1. 以解决临床需求为出发点，建设mNGS标准化检测体系
mNGS为较前沿的分子诊断技术，标准化的难度较大，需要进行反复摸索和验证。目前病原mNGS平台目前已拥有具有湿实验和干试验操作能力的技术人员5人，结果分析人员3人。同时拥有国内较为先进的建库和测序系统。目前已经累计完成科研型标本检测500余份，包含脑脊液、肺泡灌洗液和血浆等在内的10余种标本类型，有力支持了神经内科、急诊科、感染科、呼吸科、ICU等20多个科室的疑难感染性病原学诊断，并诊断出马尔尼菲蓝状菌、伯氏考克斯体等罕见的感染病例，得到了临床科室积极肯定的反馈。同时，实验室积极推动行业进展，开展中枢神经系统感染病原体mNGS核酸检测试剂盒、呼吸道感染mNGS的临床试验，为该技术正式应用于临床检测打下坚实基础。
图3. mNGS测序平台
图4. 自动化建库仪和测序仪
2. mNGS湿实验的自动化和速度优化
宏基因组测序“湿实验”实验流程耗时长，操作繁琐；上机测序同样耗时长，无法实现实时监测病原检出情况，整套技术操作下来几乎需要耗费20小时。这两点限制了宏基因组测序报告的及时性。针对于这两大痛点，实验室科研引进自动化建库系统，在提高了“湿实验”过程的标准化之外，将实验流程缩短了将近一半。目前正在开发宏基因组病原微生物极速检测流程，目标是能实时以及快速的分析测序数据，更快为临床提供可靠的病原学检测结果。
3. 背景核酸的识别
宏基因组学进行感染性疾病的诊断过程中有一个问题是容易引入非标本来源核酸导至假阳性或干扰正确的结果判读。导至假阳性的因素很多，样本采集、核酸提取、建库测序试剂、环境等等引入的污染，都可以导至检测结果假阳性。目前，实验室成功研发实验室环境和试剂中背景核酸的识别模型，通过建模和经验证的算法过滤背景微生物，检测结果的准确性得到了有效的提高。
图5. 背景菌模型过滤效果
4.去宿主核酸技术的探索
宿主核酸是关系到病原mNGS检测灵敏度的一大原因，对于宿主核酸较多的标本宜用合适的方法进行一定的去宿主操作，实验室已评估saponin、molysis、SDS等各种去宿主试剂的效果，摸索出一个较合适的去宿主策略。
图6.不同方法去除宿主核酸效果比较
5. mNGS结果解读
新技术的应用给临床诊疗提供了很大的帮助，同时也衍生出新的问题。一份标本检测出的病原核酸种类往往可达上百甚至上千种，如果没有一套好的解读策略很难给出明确的致病源，结果的不准确会误导临床治疗甚至直接导至诊疗失败。宏基因组检测技术的初步临床应用让实验室团队意识到宏基因组检测需要密切结合临床进行结果解读。因此，在杨启文副主任的带领下，实验室频繁开展临床沟通会，了解临床需求，并系统摸索宏基因组学的规范化检测和报告解读模式。
近日，国家卫生健康委临床检验中心公布了2020年的全国下呼吸道感染宏基因组测序室间质量评价预研活动结果报告，全国共有90家开展病原宏基因组学检测的实验室反馈的结果有效。本实验室满分通过室间质评，为5家满分实验室之一。
6.积极开展教学培训，带动行业共同进步
为解决目前NGS技术在临床微生物检测和感染病诊疗中存在的问题，进一步交流经验、提高学术水平，促进NGS技术在病原微生物检测方面的临床应用规范，引导建立mNGS检测的标准化质控体系。本实验室依托华人抗菌药物敏感性试验委员会（ChiCAST），开展了“协和-杰毅杯mNGS全国病例大赛”活动，旨在通过病例交流，与各位共同讨论典型临床实践，探索精准诊疗的新发展、新概念与新模式。目前本活动正在火热进行中。同时，团队也依托全国真菌病监测网，将于今年组建“mNGS病例会诊专家联盟”。
图8. mNGS病例大赛
7. 科研
团队对mNGS的核心定位主要是提升临床诊断疑难感染性疾病的能力，但也同时附带开展了一系列科学研究。我们从一例非艾滋患者肺泡灌洗液中检出马尔尼菲篮状菌，对其进行了全基因组测序和溯源等研究，成果已经在IDCASES杂志发表；团队也对比研究了宏基因组测序技术和常规PCR技术在PCP检测上的性能差异，目前审稿中；mNGS极速检测流程和背景菌识别模型都已经形成成果。
图9.马尔尼菲篮状菌病例报道
8. 后续工作
2020年6月，北京协和医院病原体核酸检测中心成立，已经通过了相关部门验收。中心除了具备新冠病毒核酸检测能力、常规病原学核酸检测能力外，同时将整合病原宏基因组测序平台。2021年9月，协和将迎来建院百年，面对新的契机和挑战，协和检验人将以更加积极的心态、认真的工作态度传承协和精神。
图10.赵玉沛院长、张抒扬书记2020年现场验收检验科病原体核酸检测中心