Klenow Fragment (3′→5′exo-)

组分:Klenow片段 (3?→5?exo-) (5 U/μl)40 μl×5；10× Klenow (3?→5? exo-)缓冲液1.5 ml×5。
概述：Klenow片段 (3?→5?exo-) 是大肠杆菌DNA聚合酶I的蛋白水解物。该酶保留了DNA聚合酶活性但失去了5?→3?核酸外切酶活性。
该酶经突变 (D355A，E357A) 去除了其3?→5?核酸外切酶活性。
来源：重组E.coli菌株，该菌株的质粒上携带有E.coli的polA基因的片段，该基因经突变 (D355A，E357A)，以密码子324为起始位点。
应用：1. 随机引物探针的合成。2. 双脱氧法DNA序列测定 (Sanger法)。3. 合成cDNA第二条链：Klenow Fragment (3?→5?exo-) (5,000 U/ml)0.04 ml；10×Klenow (3?→5?exo-) Buffer1.5 ml。
贮存溶液：25 mM Tris-HCl (pH 7.4 @ 25°C)，0.1 mM EDTA，1 mM Dithiothreitol (DTT)，50%甘油 (V/V)。
反应条件：1×Klenow片段 (3?→5? exo-) 反应缓冲液，添加dNTPs (不随酶附赠)，37°C温育。
1×Klenow片段 (3?→5? exo-) 反应缓冲液：10 mM Tris-HCl (pH 7.9 @ 25°C)，50 mM NaCl，10 mM MgCl2，1 mM DTT。
活性定义：1单位指在37°C条件下，反应30分钟能使10 nmol的dNTPs掺入酸不溶性沉淀物所需的酶量。
活性检测条件：1×Klenow片段 (3?→5? exo-) 反应缓冲液中加入33 μM dNTPs包括[3H]-dTTP和70 μg/ml热变性鲱鱼精DNA。
DNA序列测定：如果用双脱氧法进行DNA序列测定 (Sanger等)，建议在每5 ?l反应体系中加入1 U的Klenow片段 (3?→5? exo-)。
热失活：75°C温育20分钟即可失活。